ИФА или ИХЛА?

ИФА или ИХЛА: какой метод выбрать для современной лаборатории?

Автор: Иванов Дмитрий Сергеевич, специалист по направлению «Иммунодиагностика» АО «ДИАКОН».

Основные задачи современной лаборатории — расширять перечень исследований и сокращать сроки выдачи результатов. Для этого необходима автоматизация, которая предполагает выбор подходящих технологий и оборудования. При проведении серологических исследований — это общее понятие, включающее определение маркеров инфекционных заболеваний, онкомаркеров, гормонов, витаминов и других показателей — наибольшее практическое применение получили методы ИФА и ИХЛА. Поэтому перед лабораториями часто встаёт вопрос: какой из этих методов выбрать?

И ИФА, и ИХЛА относятся к иммунологическим методам исследования, поскольку основаны на взаимодействии антиген—антитело. Именно это обеспечивает им высокую специфичность. Основные различия между методами касаются площади реакционной поверхности и способа детекции результата.

Реакционная поверхность

В ИФА реакционной поверхностью является лунка 96-луночного планшета, на которой иммобилизованы антитела или антигены нужной специфичности. Площадь поверхности лунки ограничена. На ней можно сорбировать только определённое количество молекул, что ограничивает диапазон выявляемых концентраций. Если концентрация молекул в образце превышает количество доступных мест связывания на поверхности, часть молекул не вступает в реакцию и не учитывается при определении результата.

Кроме того, для ИФА характерно достаточно продолжительное время инкубации. Молекулы, распределённые в объёме лунки, должны диффундировать к её стенкам и вступить в реакцию с антигенами или антителами, иммобилизованными на поверхности. Для ускорения диффузии разработчики используют перемешивание содержимого лунки, однако даже в этом случае время инкубации в ИФА составляет от 20–30 минут до нескольких часов.

В ИХЛА антитела или антигены нужной специфичности иммобилизованы на поверхности парамагнитных частиц. Их суммарная площадь поверхности значительно больше площади лунок планшета. Это позволяет связать большее количество молекул и расширить динамический диапазон метода.

Кроме того, во время исследования парамагнитные частицы образуют суспензию с образцом. Это значительно сокращает расстояние, которое молекулы должны преодолеть до поверхности частиц, где находятся антитела или антигены. Поэтому в современных наборах для ИХЛА время инкубации может составлять всего 9 минут.

Способ детекции

Ещё одно различие между ИФА и ИХЛА связано со способом детекции результата. В ИФА используется спектрофотометрия, а в ИХЛА — иммунохемилюминесценция или электрохемилюминесценция.

В ИФА, как правило, используется реакция окисления ТМБ перекисью водорода под действием фермента пероксидазы. У этого подхода есть несколько ограничений.

Во-первых, спектрофотометрия основана на измерении уменьшения светового потока при прохождении через раствор, поглощающий свет. Для уверенной регистрации изменения светового потока необходимо определённое количество окрашенных молекул. Поэтому требуется время для образования достаточного количества окисленного субстрата. Например, инкубация с ТМБ для развития окраски обычно занимает от 15 до 30 минут.

В ИХЛА используется другой принцип: регистрируются фотоны, излучаемые практически в полной темноте. Это повышает чувствительность детекции и сокращает время измерения. Сама стадия регистрации сигнала занимает доли секунды. Больше времени — несколько секунд — занимает перенос реакционной смеси в измерительную камеру.

Таким образом, ИФА и ИХЛА принципиально различаются по продолжительности анализа, чувствительности и диапазону измеряемых концентраций.

Сравнение ИФА и ИХЛА

Рассмотрим несколько востребованных в клинико-диагностических лабораториях исследований: ТТГ, общий ПСА и прокальцитонин. Ниже приведены сравнительные характеристики ИФА-наборов производства компании «Вектор-Бест» и ИХЛА-наборов производства компании Lifotronic.

Как видно из приведённых данных, наборы существенно различаются по чувствительности, диапазону измеряемых концентраций и продолжительности инкубации. По всем трём параметрам наборы для ИХЛА превосходят наборы для ИФА.

Почему это важно?

Более высокая скорость получения результата при использовании ИХЛА позволяет проводить срочные исследования. Это особенно важно при определении таких маркеров, как прокальцитонин и тропонин, результаты которых необходимы клиницистам для оперативного принятия решений.

Показателен пример с общим ПСА. Для ИФА диапазон измеряемых концентраций составляет от 0,1 до 40 нг/мл, а для ИХЛА — от 0,003 до 100 нг/мл. Для онкологов важно точно определять, как высокие, так и низкие концентрации ПСА. Метод ИХЛА позволяет делать это в широком диапазоне без дополнительных манипуляций. При использовании ИФА для определения концентраций ПСА выше 40 нг/мл необходимо вручную развести образец, например, в 10 раз, и повторить исследование. Это увеличивает время получения результата и может повлиять на его точность: предварительное разведение образца повышает вероятность ошибки. Кроме того, повторное исследование требует дополнительных реагентов и времени сотрудников. При обследовании пациентов после простатэктомии чувствительности 0,1 нг/мл недостаточно: после операции общий ПСА должен определяться в концентрации менее 0,1 нг/мл. Для ИФА существуют наборы с чувствительностью 0,01 нг/мл и диапазоном измерения от 0,01 до 5 нг/мл.

Таким образом, для разных задач — скрининга и обследования пациентов после простатэктомии — приходится использовать два разных набора. Это усложняет организацию работы: необходимо разделять потоки исследований и контролировать, какой набор используется для каждого образца. При использовании ИХЛА один набор позволяет решать обе задачи. Его чувствительность 0,003 нг/мл достаточна для обследования пациентов после операции, а диапазон от 0,003 до 100 нг/мл подходит для скрининговых исследований.

Пример с общим ХГЧ

Ещё один показательный пример — определение общего ХГЧ.

Для ИХЛА на примере наборов компании Lifotronic диапазон измерения составляет от 0,5 до 10 000 Ед/мл. При превышении верхней границы диапазона анализатор может автоматически развести образец и повторить исследование. Это избавляет сотрудников лаборатории от необходимости заранее определять предполагаемый диапазон результата и выполнять предварительное разведение образца. При использовании ИФА такую процедуру часто приходится проводить вручную.

В ИХЛА результат может быть получен примерно через 20 минут или максимум через 40 минут — при автоматическом разведении и повторном измерении. В ИФА исследование занимает не менее 75 минут, если разведение было выбрано правильно, и не менее 150 минут, если при первом измерении концентрация превысила верхний калибратор. При ручном разведении сотруднику также необходимо отслеживать, для какого образца и в каком соотношении требуется выполнить разведение. Для разных образцов это соотношение может отличаться. Если результат выходит за пределы диапазона, образец необходимо развести повторно и дополнительно поставить в работу. Таким образом, при использовании ИФА увеличиваются затраты времени и труда сотрудников лаборатории.

Ниже приведён типичный пример рекомендаций по предварительному разведению сывороток пациенток перед исследованием в зависимости от предполагаемого срока беременности. Данные приведены для набора «ХГЧ-ИФА» производства ООО «Хема».

• 1-2 неделя: без разведения
• 3-4 неделя: 1:20
• 4-14 неделя: 1:400
• 14-21 неделя: 1:400; 1:1000
• 22 неделя, 3-ий триместр: 1:400

Многие преимущества ИХЛА связаны с тем, что эта технология изначально разрабатывалась для автоматических анализаторов. ИФА появился значительно раньше, когда об автоматизации лабораторных процессов практически не говорили.

Со временем для ИФА также были разработаны автоматические системы, однако они не устраняют ряд ограничений метода: различные схемы постановки, разное время и температура инкубации, а иногда и необходимость использовать разные типы пластика. Рассмотрим исследования так называемой «госпитальной четвёрки»: HBsAg, антитела к HCV, антитела к возбудителю сифилиса, антитела к ВИЧ и антиген p24.

Зачастую все эти маркеры необходимо определять одновременно. При использовании ИФА это может быть затруднительно из-за несовместимости методик. Под совместимостью понимается одинаковая схема постановки: количество стадий, температура и время инкубации. При одинаковых параметрах исследования можно выполнять последовательно, используя единый рабочий процесс. В ИФА методики определения перечисленных маркеров могут существенно различаться.

Во-первых, различается объём образца. Сотруднику необходимо переносить один и тот же образец в разные лунки и планшеты. Для этого потребуется использовать несколько дозаторов с разными объёмами или постоянно перенастраивать один дозатор.

Во-вторых, существенно различаются схемы постановки. При работе с одинаковыми методиками сотрудник может последовательно обрабатывать планшеты по единому алгоритму. В данном случае возникают ситуации, когда один планшет ещё находится на стадии внесения образцов или промывки, а для другого уже завершилась инкубация и необходимо продолжать работу.

Дополнительные сложности связаны с термошейкерами. В идеальном случае для каждой методики потребуется отдельный прибор, чтобы использовать встроенный таймер. Если один термошейкер используется для нескольких методик, сотруднику приходится самостоятельно отслеживать время инкубации каждой из них.

Для HBsAg требуется отдельный температурный режим: инкубация в течение 1 часа при 44 °C либо в течение 2 часов при 37 °C. Это также усложняет организацию работы.

Единичные постановки в ИХЛА

Важным преимуществом ИХЛА является возможность проводить единичные постановки без накопления партий образцов. Это связано с тем, что технология изначально разрабатывалась для автоматизации и проведения исследований в отдельных реакционных пробирках. В результате для каждой пробирки обеспечиваются одинаковые условия проведения анализа.

Калибровку, контрольные материалы и образцы можно обрабатывать независимо друг от друга. При использовании ИХЛА калибровка проводится при получении новой серии реагентов и, как правило, действует в течение 28 дней. В последующие рабочие дни можно отдельно выполнять постановки контрольных материалов и образцов. В ИФА калибровку необходимо проводить при каждой постановке независимо от количества образцов. Поэтому лаборатории вынуждены накапливать образцы и выполнять исследования большими партиями.

Такая организация работы приводит к дополнительным сложностям. Образцы приходится хранить в лаборатории в течение нескольких дней, распределять исследования по расписанию — например, одни тесты выполнять в понедельник, другие во вторник — и постоянно отслеживать, какие пробирки уже обработаны, а какие ещё содержат невыполненные назначения. При использовании ИХЛА этих ограничений нет. Для поступившего образца можно выполнить все необходимые исследования в течение первого дня, после чего передать его в архив.

Вывод

Основные преимущества ИХЛА — технологичность, высокая скорость получения результатов, большая чувствительность и широкий диапазон измеряемых концентраций.

Для лаборатории это означает более простой рабочий процесс, сокращение количества ручных операций, уменьшение затрат времени сотрудников и снижение вероятности ошибок при выполнении исследований.