УТВЕРЖДЕНА

Приказом Росздравнадзора

от   13 апреля  2011 г.  №  1906-Пр/11

	                             «УТВЕРЖДАЮ»
               Генеральный директор
               Закрытого акционерного общества                     
               «ДИАКОН-ДС»  
                                                     Шарышев А.А.
                                                      04 февраля  2011 г.	
И Н С Т Р У К Ц И Я
по применению набора реагентов для определения активности аланинаминотрансферазы 
динитрофенилгидразиновым методом по конечной точке в сыворотке крови
(АЛТ  КТ  «ДДС»)
                                                                                                                                                              РУ № ФСР 2011/10443
НАЗНАЧЕНИЕ
	Набор предназначен для количественного определения активности аланинаминотрансферазы (АЛТ) в сыворотке крови по конечной точке динитрофенилгидразиновым методом в клинико-диагностических и биохимических лабораториях и научно-исследовательской практике.
	Набор выпускается в двух видах фасовки и рассчитан, соответственно, на проведение 400 или 800 измерений при расходе 0,25 мл реагента 1 на одну пробу.
ПРИНЦИП  МЕТОДА
           В основе определения активности АЛТ с динитрофенилгидразином лежит метод Райтмана-Френкеля.
           Аланинаминотрансфераза в присутствии α-кетоглутарата катализирует реакцию переаминирования L-аланина с образованием пирувата.                                                  АЛТ                        
                                    α-кетоглутарат + L-аланин —> L-глутамат + пируват.

           Пируват с 2,4-динитрофенилгидразином в щелочной среде образует окрашенный гидразон, интенсивность окраски которого прямо пропорциональна активности АЛТ и измеряется фотометрически при длине волны 505(500-560) нм.

СОСТАВ  НАБОРА
           Реагент 1: субстратно-буферный раствор, pH 7,4, содержащий калий фосфорнокислый однозамещенный, 100 ммоль/л; DL-аланин, 200 ммоль/л; α-кетоглутарат, 2,0 ммоль/л; динатриевую соль этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА), 5,0 ммоль/л; азид натрия, 0,095% – 1 флакон (100 мл) или 2 флакона (по 100 мл).
Реагент 2: раствор, содержащий 2,4-динитрофенилгидразин, 1,0 ммоль/л; соляную кислоту, 1,0 моль/л – 1 флакон (100 мл) или 2 флакона (по 100 мл).
Реагент 3: концентрированный раствор гидроокиси натрия, 4,0 моль/л – 1 флакон (100 мл) или 2 флакона (по 100 мл).
Калибратор: калибровочный раствор пирувата натрия, 1,0 ммоль/л; азид натрия, 0,095% – 1 флакон (3,0 мл) или 2 флакона (по 3,0 мл). 
АНАЛИТИЧЕСКИЕ  ХАРАКТЕРИСТИКИ
Набор обеспечивает линейную область определения активности аланинаминотрансферазы в диапазоне от 4,0 до 70 Е/л, отклонение от линейности не превышает 7%. Чувствительность – не более 3,0 Е/л, коэффициент вариации результатов определений – не более 7%.
	Качество набора можно оценивать по отечественным или зарубежным контрольным сывороткам, аттестованным данным методом.
	Нормальные величины активности аланинаминотрансферазы в сыворотке крови человека составляют 4,0 –12 Е/л.
	Рекомендуется в каждой лаборатории уточнить диапазон значений нормальных величин для обследуемого контингента людей.

ОБРАЗЦЫ
	Негемолизированная сыворотка крови. Сыворотку крови следует отделить от форменных элементов крови не позднее, чем через 1 час после забора крови.
МЕРЫ  ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ
	В реагентах 1 и 4 содержится токсичный компонент – азид натрия, реагент 3 содержит гидроокись натрия. При работе с ними следует соблюдать осторожность и не допускать попадания на кожу и слизистые; при попадании немедленно промыть пораженное место большим количеством проточной воды. При проглатывании следует выпить 0,5 л теплой воды и вызвать рвоту.
	Меры предосторожности – соблюдение “Правил устройства, техники безопасности, производственной санитарии, противоэпидемического режима и личной гигиены при работе в лабораториях (отделениях, отделах) санитарно-эпидемиологических учреждений системы Министерства здравоохранения” (Москва, 1981 г.).
При работе с набором следует надевать одноразовые резиновые или пластиковые перчатки, т.к. образцы крови человека следует рассматривать как потенциально инфицированные, способные длительное время сохранять и передавать ВИЧ, вирус гепатита или любой другой возбудитель вирусной инфекции.

ОБОРУДОВАНИЕ  И  РЕАГЕНТЫ:
 Спектрофотометр, программируемый фотометр или биохимический анализатор, длина  
   волны 505(500-560) нм, кювета с длиной оптического пути 10 мм;
 термостат, обеспечивающий температуру +37 ± 1°С;
 секундомер;
 пипетки, позволяющие отбирать объемы жидкости 0,02, 0,100 и 1,0 мл;
 пробирки стеклянные вместимостью 5,0-10 мл;
 колба мерная вместимостью 1000 мл;
 вода дистиллированная;
 0,9% раствор NaCl (физиологический раствор);
 перчатки резиновые или пластиковые.

ПОДГОТОВКА  К  АНАЛИЗУ
	Приготовление щелочного раствора. 
В мерную колбу вместимостью 1000 мл внести 100 мл реагента 3, довести объем до метки дистиллированной водой и перемешать.
Щелочной реагент можно хранить при температуре +2–25°С в течение всего срока годности набора при условии достаточной герметичности флакона.
Реагенты 1, 2 и 4 готовы к использованию.

ПРОВЕДЕНИЕ  АНАЛИЗА
               Компоненты реакционной смеси отбирать в количествах, указанных в таблице 1.
                                                                                                                                                                           Таблица 1.
Отмерить, мл	Опытная
проба	Контрольная
(холостая) проба	Контрольная
проба на сыворотку	
Реагент 1	0,25	0,25	0,25	
Инкубировать при температуре +37°С в течение 5 минут, добавить	
Сыворотка крови	        0,05	                —	                          —	
Дистиллированная вода	         —	              0,05	                          —	
Перемешать и инкубировать при температуре +37°С точно 30 минут, добавить	
Реагент 2	0,25	              0,25	                         0,25	
Сыворотка крови	—	                —	                         0,05	
Перемешать и выдержать при комнатной температуре (+18-25С) в течение 20 минут, добавить	
Щелочной раствор	    2,5	               2,5	                          2,5	
               
                Пробы тщательно перемешать и выдержать при комнатной температуре в течение 5 минут. Измерить оптические плотности опытной пробы (Е1) и контрольной пробы на сыворотку (Е2) против контрольной (холостой) пробы в кювете с длиной оптического пути 10 мм при длине волны 505(500-560) нм. Окраска растворов стабильна в течение 30 минут.
	Для определения активности АЛТ использовать разность оптических плотностей (Е) опытной пробы и контрольной пробы на сыворотку:  Е = Е1 – Е2.                          
РАСЧЕТЫ
	Расчет активности аланинаминотрансферазы в сыворотке крови произвести по калибровочному графику. Компоненты реакционной смеси для построения калибровочного графика отбирать в количествах, указанных в таблице 2.

ПОСТРОЕНИЕ КАЛИБРОВОЧНОГО ГРАФИКА
                                                                                                                                                                        Таблица 2.
№№
пробирок	Калибратор
	Дистиллированная вода	Реагент 1	Реагент 2	Активность АЛТ	
	мл	Е/л	мккат/л	
1	—	0,1	0,50	0,5	—	—	
2	0,05	0,1	0,45	0,5	17	0,28	
3	0,10	0,1	0,40	0,5	34	0,56	
4	0,15	0,1	0,35	0,5	50	0,83	
5	0,20	0,1	0,30	0,5	67	1,11	
6	0,25	0,1	0,25	0,5	83	1,39	
              
             После добавления Реагента 2 пробы тщательно перемешать, выдержать при комнатной температуре (+18-25С)  в течение 20 минут, затем во все пробирки добавить по 5,0 мл щелочного раствора, тщательно перемешать, выдержать при комнатной температуре в течение 5 минут. Измерить оптическую плотность растворов в пробирках №№ 2-6 против раствора в пробирке № 1 в кювете с длиной оптического пути 10 мм при длине волны 505(500-560) нм. Окраска растворов стабильна в течение 30 минут. 
                Построить калибровочный график, откладывая на оси ординат значения оптической плотности для каждой пробы, а на оси абсцисс – соответствующие им значения активности АЛТ.

УСЛОВИЯ  ХРАНЕНИЯ  И  ЭКСПЛУАТАЦИИ  НАБОРА
	Хранение наборов должно производиться в темном месте при температуре +2–8°С в упаковке предприятия-изготовителя в течение всего срока годности. Допускается хранение наборов при температуре до +250 С не более 5 суток. Замораживание компонентов набора не допускается.
	Срок годности наборов — 12 месяцев.
Реагенты 1, 2 и 3 после вскрытия флаконов могут храниться при температуре +2–80С в темном месте в течение всего срока годности наборов при условии достаточной герметичности флаконов.
Щелочной реагент можно хранить при температуре +2–25°С в течение всего срока годности набора при условии достаточной герметичности флакона.
Калибратор после вскрытия флакона можно хранить при температуре +2–8°С в течение 3 месяцев при условии достаточной герметичности флакона.
	При активности аланинаминотрансферазы в сыворотке крови выше 70 Е/л анализируемую пробу следует развести физиологическим раствором в 4 раза, повторить анализ и полученный результат умножить на 4.
	Для получения надежных результатов необходимо строгое соблюдение инструкции по применению набора.
	По вопросам, касающимся качества набора АЛТ КТ «ДДС», следует обращаться в ЗАО «ДИАКОН-ДС» по адресу: 142290, г. Пущино, Московской обл., ул. Грузовая 1а; тел. (495) 980-63-38,  980-63-39;  т/факс (495) 980-66-79.
               
               Директор по производству 
                 ЗАО «ДИАКОН-ДС»                                                               Сысоева В.И.
                                
                 “СОГЛАСОВАНО”
   Зав. кафедрой клинической
   лабораторной диагностики ГОУ ДПО
   “РМАПО Росздрава, д.м.н., профессор                                   Долгов В.В.
                                                                                                         08 февраля 2011 г.